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本文歸納了滅活病毒的若干種方式及其滅活原理，大家可據(jù)此尋找合適的消殺方法。同時，我們還會看到，新冠滅活疫苗也許還有更多的發(fā)展空間。

撰文 | 彭程（清華大學(xué)李賽實驗室博士研究生）、李賽（清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心研究員）

人類的發(fā)展歷史也是一部病毒抗爭史，回顧歷史長河，病毒已對人類展開過無數(shù)次猛烈的進攻。根據(jù)推測，天花病毒在一萬多年前就已經(jīng)出現(xiàn)，直到1980年之前一直在世界各地橫行。天花致死率很高，僅在20世紀就造成全世界約3億人死亡[1]。流感病毒在近一百多年也多次肆虐全球，僅1918年的西班牙大流感便奪去了數(shù)以千萬計的生命[2]。此外，人類免疫缺陷病毒（俗稱“艾滋病毒”）、埃博拉病毒、肝炎病毒依舊對人類虎視眈眈，當前新型冠狀病毒也因其突變株的不斷出現(xiàn)而持續(xù)表現(xiàn)出強勁的傳播特性。截至目前，本次新冠疫情的死亡人數(shù)也已經(jīng)上升到人類歷史上病毒瘟疫致死人數(shù)的第三位（自Wikipedia）。面對這個看不見的敵人，人類仿佛顯得有些被動，難道我們不能主動去“殺死”病毒嗎？

其實在還未認識病毒時，人類就已經(jīng)摸石頭過河，摸索出了一些“殺死”病毒的方法。我國古代醫(yī)學(xué)對此也有所記載，有些方法現(xiàn)在來看仍具有科學(xué)指導(dǎo)意義。如李時珍在《本草綱木》中記載的“天氣瘟疫，取出病人衣服于甑上蒸過，則一家不染”就是利用高溫“殺死”病毒的例子。隨著生物學(xué)、物理學(xué)、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和化學(xué)的進步，人類對病毒的認知也從原來的“邪氣”、“上帝的懲罰”到現(xiàn)在的“一種專營寄生的微小生物顆?！保@也為“殺死”病毒的手段開發(fā)提供了生物學(xué)依據(jù)。

如今，人們已經(jīng)擁有多種“殺死”病毒的手段，有些能破壞病毒結(jié)構(gòu)而快速“殺死”病毒，如酒精（破壞囊膜）、高溫（蛋白變性），這類也是目前消殺的常用手段，有些方法能在“殺死”病毒的基礎(chǔ)上保留病毒的免疫原性或結(jié)構(gòu)完整性，如甲醛（固定蛋白）、β-丙內(nèi)酯（破壞核酸），病毒被它們“殺死”后常被用來制備疫苗或用作病毒的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。

如何才能“殺死”病毒？

其實，“殺死病毒”這個表述并不準確。病毒可謂是大自然以“極簡主義”設(shè)計的生物體之一，其構(gòu)造簡單到僅剩蛋白/脂膜包裹的核酸。在體外它不會自我復(fù)制，沒有能量消耗，也沒有物質(zhì)的合成與分解，貌似就是個“死”的狀態(tài)，但它一旦侵入到細胞內(nèi)，又可以將整個細胞變成自己的生產(chǎn)工廠，繁殖出更多的病毒顆粒來。因此，病毒是否有生命這個話題一直沒有明確的答案。前文所說的“殺死”，其實是指讓病毒失去繁殖的能力，也就是讓病毒哪怕遇到宿主也別再“活過來”。在體外，這一過程在病毒學(xué)界則被稱為“滅活”。

若想阻斷病毒的繁殖，首先得要了解病毒的生活周期。病毒顆粒通過其表面的蛋白作為“鑰匙”識別宿主并進入胞內(nèi)，利用細胞的原料和能量復(fù)制自己的基因組，合成自己的蛋白，這些新合成的基因組和結(jié)構(gòu)蛋白會裝配成子代病毒顆粒后被釋放到胞外。針對病毒的生命活動過程，滅活的思路大體分為三種，一種是破壞病毒的整體結(jié)或病毒的蛋白結(jié)構(gòu)，使其喪失侵入細胞的能力，另一種是“鎖住”病毒的蛋白，使其無法發(fā)揮功能，最后是破壞病毒的基因組，使其基因組無法在胞內(nèi)復(fù)制。

新冠病毒與流感病毒的生活周期[3]。

新冠病毒（左）和流感病毒（右）的生命周期都經(jīng)歷以下步驟：

①進入細胞。病毒顆粒表面蛋白與受體識別，發(fā)生膜融合并釋放遺傳物質(zhì)；

②基因組復(fù)制。新冠病毒誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生雙膜囊泡（DMV）[4]作為其基因組復(fù)制的場所，流感病毒在細胞核中進行基因組復(fù)制；

③病毒蛋白翻譯；

④病毒顆粒組裝和出芽。新冠病毒的組裝發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體中間體（ERGIC），流感病毒在細胞膜上組裝；

⑤子代病毒釋放。

基于以上思路，各種各樣病毒滅活的方法也隨之誕生。根據(jù)滅活方式分類，可分為化學(xué)滅活和物理滅活兩種。不同的滅活方法對病毒產(chǎn)生不同的影響，有的方法可以快速滅活病毒，有的方法能夠在滅活病毒的基礎(chǔ)上保留病毒的蛋白結(jié)構(gòu)或免疫原性?？茖W(xué)家們也基于不同的滅活手段進行著下游的科研，如快速消毒手段的建立、病毒的結(jié)構(gòu)解析、滅活疫苗的開發(fā)等。本文將簡要介紹幾種主要的病毒滅活手段及原理。

化學(xué)滅活

甲醛

大家對甲醛應(yīng)該不陌生，它的水溶液就是大名鼎鼎的福爾馬林，是一種防腐劑和固定劑。甲醛含有一個電子缺失的中心碳原子，是親電子的，因此可以與親核體發(fā)生親核加成反應(yīng)。它可以使蛋白質(zhì)氮端的氨基以及側(cè)鏈含氮的氨基酸（如賴氨酸、精氨酸、酪氨酸等）單羥基化，并進一步脫水形成亞胺中間體，而這些中間體可以與與精氨酸、酪氨酸的殘基再次反應(yīng)形成亞甲基橋，發(fā)生交聯(lián)。此外，甲醛也可以使腺嘌呤單羥基化，阻止基因的讀取[5]。因此，甲醛既可以對病毒的蛋白和基因組實現(xiàn)雙重打擊，還能通過交聯(lián)固定病毒蛋白的結(jié)構(gòu)。由于甲醛能“鎖定”蛋白結(jié)構(gòu)，甲醛滅活既是滅活疫苗開發(fā)的主要候選手段，也是結(jié)構(gòu)生物學(xué)家在病毒結(jié)構(gòu)解析中常用的病毒滅活方式[6]。

甲醛與腺嘌呤和賴氨酸的反應(yīng)原理[5]

β-丙內(nèi)酯

β-丙內(nèi)酯是一種主要針對鳥嘌呤的烷化劑，也被認為是一種傾向于破壞核酸的滅活試劑。親電的β-丙內(nèi)酯可與鳥嘌呤發(fā)生親核取代反應(yīng)，使β-丙內(nèi)酯開環(huán)和鳥嘌呤烷基化，導(dǎo)致病毒基因組失活[5]。目前，β-丙內(nèi)酯是滅活疫苗開發(fā)中最廣泛使用的滅活劑，但有研究表明β-丙內(nèi)酯也會對部分氨基酸進行修飾，發(fā)生酰化和交聯(lián)反應(yīng)[7]。

β-丙內(nèi)酯與鳥嘌呤的反應(yīng)原理[5]

乙醇

乙醇也就是酒精。乙醇對病毒的滅活速度很快，尤其是囊膜病毒。囊膜病毒是一類外層由脂雙層包裹的病毒。由于乙醇具有脂、水雙親性，因此乙醇可以增強膜對水的親和力，同時減少非極性氨基酸殘基之間的相互作用，從而既能破壞病毒的整體結(jié)構(gòu)，又能使病毒蛋白質(zhì)變性[8]。

2021年，Das等人通過分子動力學(xué)模擬的手段描述了乙醇對囊膜病毒的破壞作用，病毒在75%乙醇溶液浸泡后，其囊膜會發(fā)生瓦解并導(dǎo)致內(nèi)容物的釋放[9]。新冠病毒也是一種囊膜病毒，2020年Annika Kratzel經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，新冠病毒在高于30%酒精溶液中浸泡30秒后其感染力可下降至本底水平[10]。除乙醇之外，還有很多醇類化合物也能表現(xiàn)出較快的滅活速度，如正丙醇、異丙醇等[10]。由于這些化合物具有滅活速度快，毒性小的特點，因此常被用作洗手液的主要成分和物品的表面消毒劑等。

醇類化合物破壞新冠病毒的原理圖[8]

物理滅活

溫度

高溫也是一種常見和常用的滅活手段。在高溫的作用下，維持病毒蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵會被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，使病毒喪失侵染細胞和復(fù)制的能力。加泰羅尼亞理工大學(xué)的Didac Martí等人利用分子動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)高溫會引起新冠病毒表面的蛋白尤其是表面蛋白的受體結(jié)合區(qū)域發(fā)生結(jié)構(gòu)變化和氫鍵重排[11]。此外，高溫還可以使核酸的骨架發(fā)生斷裂。

值得一提的是，目前認為“較低”高溫（低于41℃）就可以使病毒基因組發(fā)生斷裂，而不影響蛋白結(jié)構(gòu)和功能[5]。2020年，巴斯德研究院的Christophe Batéjat對新冠病毒的鼻咽拭子樣品進行56℃、65℃和95℃的高溫處理，發(fā)現(xiàn)分別經(jīng)過了20min、10min和3min便會使新冠病毒失活[12]。高溫滅活的手段因其效果穩(wěn)定且具有廣譜性，現(xiàn)在也是作為生物安全廢棄物處理的必需步驟。

紫外光

紫外光是頻率比藍紫光高的不可見光。根據(jù)國際標準化組織（ISO）的標準，紫外光可根據(jù)波長進一步分為UVA波段（320–400 nm）、UVB波段（280-320 nm）和UVC波段（200-280nm）等。其中，UVC對病毒最具有破壞性，隨后依次為UVB、UVA[13]，因此UVC也是用來滅活病毒的主要波段。

紫外光對病毒核酸的破壞方式主要是誘導(dǎo)核酸內(nèi)部形成嘧啶二聚體。當紫外光被病毒的核酸吸收后，病毒基因組中相鄰或相對的兩個嘧啶會發(fā)生光化學(xué)融合，形成共價連接的嘧啶二聚體。嘧啶二聚體由于共價作用會給基因組的骨架引入張力，導(dǎo)致基因組骨架斷裂[5]。對部分病毒而言，紫外光能在病毒完全滅活的基礎(chǔ)上保留病毒的融合活性[14]。對于新冠病毒，經(jīng)過9分鐘的UVC照射（累計劑量1048 mJ/cm2）便可使高感染滴度（5 * 106 TCID50/mL）的新冠病毒徹底滅活[13]。雖然UVC的滅活效果好，但其穿透能力較差，普通透明玻璃、衣服、塑料等就能阻擋大部分UVC。因此，UVC常被用在器械物品表面及醫(yī)院、生物安全等級實驗室的室內(nèi)空間消毒。

相鄰尿嘧啶經(jīng)紫外光照射形成嘧啶二聚體原理圖[5]

電離輻射

電離輻射是一種能導(dǎo)致物質(zhì)原子或分子發(fā)生電離的能量。三種主要的電離輻射技術(shù)是γ輻射、電子束和X射線。γ射線是一種由原子衰變裂解時放出的射線。電子束（eBeam）即為從電子束加速器中產(chǎn)生的高能電子束。X射線是由原子核外電子的躍遷或受激等作用產(chǎn)生的射線[15]。雖然來源不同，但是對病毒滅活的機理基本類似。

電離輻射對病毒的破壞作用分為直接作用和間接作用。電離輻射可以直接將病毒體內(nèi)分子的化學(xué)鍵打斷，也可以使水分子發(fā)生電離。水分子輻解會產(chǎn)生各種各樣的高活性自由基。盡管這些自由基的存在時間極短，但其可以與周圍的蛋白和核酸反應(yīng)，產(chǎn)生極大的破壞性，間接對病毒造成損傷[15]。不過也有人認為電離輻射會主要攻擊病毒的基因組而非蛋白質(zhì)[16]。電離輻射的滅活效果與輻射劑量有關(guān)，且不同病毒存在較大差異[16]。隨著發(fā)射源技術(shù)的更新與進步，電離輻射滅活技術(shù)也開始應(yīng)用在了疫苗研發(fā)、進口國冷鏈包裝消毒等領(lǐng)域。

滅活的病毒就是滅活疫苗嗎？

談到病毒的滅活，自然就離不開滅活疫苗這個話題。疫苗的作用是為了讓我們的機體獲得抗原特異的適應(yīng)性免疫。在佐劑的輔助下，疫苗特定的免疫原性可讓我們建立起特異的免疫記憶。當下次相同病原體侵襲時，機體便能快速激活相應(yīng)的免疫系統(tǒng)，迅速清除病原體[17]。在由疫苗介導(dǎo)的免疫記憶的建立中，疫苗的免疫原性起著關(guān)鍵的作用，滅活疫苗也不例外。

雖然滅活病毒有一定的安全保障，但是并非被滅活的病毒都還具有正確的免疫原性。從分子層面來講，免疫原性的保留就是病毒表面蛋白完整性和完好性的保留。而從上文可知，病毒滅活的過程中會不可避免地影響蛋白結(jié)構(gòu)。因此，在滅活疫苗研發(fā)的過程中需要尋找一個平衡點，即，在保證穩(wěn)定徹底滅活病毒的基礎(chǔ)上，盡可能提高病毒的免疫原性。從上個世紀初開始，科學(xué)家便不斷嘗試用不同的方式制備具有免疫原性的滅活疫苗，其中也有不少已經(jīng)可以使用和普及的疫苗，包括脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、甲型肝炎病毒疫苗和狂犬病疫苗等。

目前，滅活疫苗的滅活方式仍以化學(xué)試劑為主，其制備流程大致為：病毒擴增——病毒滅活——化學(xué)試劑去毒——病毒純化——添加佐劑——裝瓶。雖然工藝看起來比較傳統(tǒng)，但在研發(fā)的過程中仍有幾大難點亟待解決：

1、在制備疫苗之前，需要獲得一株具有良好免疫效應(yīng)的穩(wěn)定種子毒株；

2、需要選擇合適的滅活劑、劑量及處理方式，以保證疫苗的免疫原性；

3、需要對滅活病毒進行高標準的純化；

4、需要較高的工業(yè)水平以支撐超大規(guī)模的快速量產(chǎn)。

這些因素導(dǎo)致一般疫苗從開發(fā)到上市都會經(jīng)歷大約10年之久。不過，出于科研、工藝水平的進步和時間的緊迫性，我國在分離出首株新型冠狀病毒毒種后不到一年半的時間內(nèi)，自主研發(fā)并上市的滅活疫苗便已經(jīng)獲得了世衛(wèi)組織的緊急使用授權(quán)。

相比于其他疫苗，滅活疫苗具有研發(fā)周期短、工藝相對成熟、安全較有保證、易于保存和運輸?shù)膬?yōu)勢。但滅活疫苗自身也有一些弱點，如為應(yīng)對病原快速變異的疫情，常需針對變異毒株更新疫苗，核酸類疫苗的更新速度相對滅活疫苗可能更快。此外，對于一些抗原穩(wěn)定性較差的病毒，傳統(tǒng)滅活方式難免會損壞免疫原性。有研究發(fā)現(xiàn)，新冠病毒經(jīng)過0.05%的β-丙內(nèi)酯4℃敷育36h后，其表面74%的蛋白構(gòu)象已不再具備正確的免疫原性[18]，這也側(cè)面說明滅活疫苗的研制仍有很大的開發(fā)潛力。

經(jīng)多聚甲醛[6]與β-丙內(nèi)酯[18]滅活的新冠病毒的結(jié)構(gòu)和腺病毒疫苗誘導(dǎo)抗原在細胞表面表達的電鏡照片[19] 。

圖A和圖B：與多聚甲醛固定后的病毒相比，β-丙內(nèi)酯滅活可能會造成刺突蛋白發(fā)生巨大的構(gòu)象變化，由倒三角形（餅圖中藍色）變?yōu)殚L柱形（餅圖中橘黃色）。但并不排除這劇烈變化是發(fā)生在病毒純化時，因為β-丙內(nèi)酯處理后的刺突蛋白較甲醛處理后具有更高的自由度。不過，這也并不代表甲醛滅活的病毒免疫原性更高，經(jīng)研究，經(jīng)甲醛固定后可能減少了刺突蛋白上受體結(jié)合區(qū)域的暴露，反而影響了免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)[20]。

圖C：一類核酸疫苗——腺病毒疫苗可直接誘導(dǎo)宿主細胞表達抗原，刺激機體免疫反應(yīng)，這種方法引入的抗原不會受到外界損壞。圖為細胞接種了腺病毒疫苗后表面表達出大量抗原。

展 望

滅活是我們主動對抗病毒的武器，除直接的消殺外，我們還可以利用滅活的病毒為我們自己添加一堵免疫城墻。尋找僅破壞核酸而不改變抗原結(jié)構(gòu)、成本低、通量高、無毒性的滅活方式，是提升滅活病毒疫苗制備工藝的目標。目前，多種物理滅活的方法也在疫苗開發(fā)上表現(xiàn)出很大的潛力，甚至有些方面更有優(yōu)勢。首先，物理滅活不會引入新的毒性，可以減去制備上去毒的操作；另外，物理滅活具有廣譜性，對不同種類或能快速變異的病毒適用性更強。此外，物理滅活還有保留較好免疫原性、制備成本低、通量高的研發(fā)潛能。目前已有利用電離輻射進行滅活疫苗研發(fā)的例子，如用γ射線滅活的流感病毒[15]、脊髓灰質(zhì)炎病毒[21]等均表現(xiàn)出一定的開發(fā)潛能。

隨著免疫學(xué)理論的不斷累積和多種滅活技術(shù)的不斷成熟，相信在不久的將來，人類在面對疫情的時候可以當即反應(yīng)，既能迅速消殺，也能快速制備疫苗，主動反擊，阻止病毒的擴散和傳播。

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